硫代葡萄糖苷是一类广泛存在于双子叶被子植物根、茎、叶和种子中的次生代谢产物，其中以十字花科为代表的植物中含量最多，种类最丰富。黑芥子酶，也称为硫代葡萄糖苷水解酶，是一种糖苷水解酶，可以催化硫代葡萄糖苷（又称为芥子苷）分解为葡萄糖和中间体糖苷配基。不稳定的糖苷配基可自发重排生成对人体健康有益的异硫氰酸盐，如苯乙基异硫代氰酸盐、3-苯丙基异硫代氰酸盐和萝卜硫素等，都具有一定的抗癌作用。其中萝卜硫素对于新冠病毒感染人体而引发的发烧具有抑制作用，并用于制作健康饮料。通过水解十字花科植物（或种子）中硫代葡萄糖苷生产异硫氰酸盐的研究很多，但是工序复杂、耗时长、成本高，且对环境造成污染。黑芥子酶催化硫代葡萄糖苷生成的异硫氰酸盐类物质绿色环保、催化过程可控，且产物稳定好。

不同来源的黑芥子酶分子质量及酶学性质差异较大（表1）。细菌与真菌相比，具有工业化发酵产酶的优势。江苏海洋大学食品科学与工程学院的朱容均、刘姝*等旨在筛选产黑芥子酶细菌菌株，并对菌株进行鉴定，对酶进行纯化和酶学性质研究。

1、产黑芥子酶菌株筛选

通过平板初筛，获得6 株产黑芥子酶菌株。其中3号菌株菌落呈淡黄色圆形，湿润黏稠，易挑起，有光泽；9号菌株菌落干燥，菌落中间凸起；32号菌株菌落呈圆形，菌落表面有褶皱，周围有网状菌。47号菌株菌落呈半透明黄色，黏稠湿润易挑起，菌落大。52号菌株菌落形态为淡黄色圆形，菌落湿润易挑起。35号菌株菌落呈淡黄色圆形，菌落小且外表湿润，显微镜下观察菌体形态为杆形，初步鉴定该菌为杆菌。将6 株菌摇瓶发酵后测定酶活力，菌株RJ35产酶水平最高（图1），因此进行下一步研究。

2、产黑芥子酶菌株RJ35的鉴定

将菌株RJ35在LB固体培养基上划线，37 ℃培养1 d后观察形态，菌落平滑、圆形、浅黄色，湿润（图2a）。菌株RJ35革兰氏阴性、杆状（图2b）。对菌株RJ35进行分子生物学鉴定，利用菌株RJ35的16S rDNA序列构建进化树，表明菌株RJ35与鞘氨醇杆菌亲缘关系最近，鉴定菌株RJ35为鞘氨醇杆菌（图3）。菌株RJ35的16S rDNA序列已经提交至，收录号为。

3、鞘氨醇杆菌RJ35黑芥子酶的纯化

超滤管分离浓缩后测定不同分子质量区间的酶液酶活力，结果显示不小于100 kDa区域酶活力最高（图4）。使用50 kDa超滤管过滤粗酶液后，将过滤好的酶液利用凝胶过滤层析进一步纯化分离蛋白，分别测定各层析管酶活力。结果显示36号收集管黑芥子酶活力最高（图5）。将该管酶液进行SDS-PAGE分析，结果显示3号泳道明显出现100 kDa蛋白条带（图6）。因此，说明菌株RJ35产黑芥子酶分子大小在100 kDa左右。

4、鞘氨醇杆菌RJ35黑芥子酶酶学性质

温度对酶活力和稳定性的影响

在不同温度下测定酶活力，40 ℃时酶活力最高。酶的热稳定性研究表明当温度处于20～60 ℃保持3 h后，菌株RJ35黑芥子酶活力保持70%以上，当温度超过70 ℃时，酶活力显著降低，说明RJ35在60 ℃以下较稳定（图7）。

pH值对酶活力和稳定性的影响

pH值对黑芥子酶活力的影响主要是由于pH值的改变导致酶蛋白变性。在pH 7.5左右时黑芥子酶活力最高，在pH 6.0、7.0、8.0时能保持较高的酶活力，偏酸性条件下酶活力降低速度相比碱性条件下平缓。该酶在pH 6.0～8.0条件下表现出稳定的酶活力（图8）。

金属离子对RJ35黑芥子酶活力的影响

如图9所示，在1 mmol/L金属离子浓度下，Na+、Ca2+、K+等离子对酶活力影响不显著，而Cu2+、Fe3+、Pb2+、Al3+对于该黑芥子酶活性具有强烈的抑制作用。

5、鞘氨醇杆菌RJ35黑芥子酶催化萝卜硫苷制备萝卜硫素

使用RJ35黑芥子酶以萝卜硫苷为底物，分解产物用高效液相色谱法鉴定其能否产生萝卜硫素。图10显示，在约9 min出现与萝卜硫素标准样品重合峰，表明该黑芥子酶具有分解萝卜硫苷产生萝卜硫素的能力，检测样品在此处峰面积为1758.89，萝卜硫素产物质量浓度为0.119 g/L。

结论

本研究筛选获得1 株新颖鞘氨醇杆菌属菌株产新颖黑芥子酶，该酶有应用于催化制备萝卜硫素的潜力。

通信作者简介

刘姝，女，博士，教授，研究生导师，江苏海洋大学食品科学与工程学院。教育部学位论文评审专家。主要从事微生物与酶技术研究。主持和参加国家自然科学基金面上项目、江苏省自然科学基金项目、江江苏省高校自然科学研究重大项目、江苏省“ 333 工程”项目、江苏省第十三批“六大人才高峰”高层次人才项目等项目10余项。指导研究生承担省级和校级创新实践计划项目3项、指导本科生承担省级和校级大学生创新创业训练计划项目5项。指导已毕业研究生1名，在校研究生12名。在《 》等学术期刊上公开发表研究论文近70余篇，其中SCI论文20余篇。授权国家发明专利3件，进入实审3件。

第一作者简介

朱容均，2020年就读江苏海洋大学食品科学与工程学院硕士研究生，研究方向为微生物发酵。

本文《产黑芥子酶鞘氨醇杆菌属菌株RJ35的筛选、鉴定及酶学性质》来源于《食品科学》2023年44卷6期214-219页，作者：朱容均，房耀维，叶沁文，侯晓月，杨光，杨运琼，刘姝。DOI:10.7506/-251。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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