黑芥子酶研究进展刘月萍王向阳（浙江工商大学，杭州３１００３５）摘要本丈综述了黑芥子酶的研究进展．概括了黑芥子酶催化硫代葡萄糖苷的水解产物对动植物、人体的作用．介绍了黑芥子酶的性质，提纯技术，活性测定，同工酶的基因家族以及产酶植物．动物和微生物．关键词黑芥子酶硫代萄萄糖苷异硫代氰酸盐十字花科１概述黑芥子酶（ＥＣ３．２．３．１），又称Ｂ．硫代葡萄糖苷酶、Ｐ．硫代葡萄糖苷水解酶，存在于十字花科植物中，是一种用以水解硫代葡萄糖苷的酶。硫代葡萄糖苷是一组低分子量‘《的物质，也存在于十字花科植物中，它是由一，｛～．蚓羚一分子葡萄糖和一个通过糖苷键连接的侧链组成。硫代葡萄糖苷酶解后产生一分子的葡萄糖和糖苷配基，糖苷配基极不稳定，随里乒ｌ＼瓷即在不同的环境条件下，重组形成异硫代氰ｋ－．一ｔ。＼严‘＾—；＿酸盐、或硫代氰酸盐、或腈类化合物、或恶唑烷硫酮等物质（如图１）。影响反应产物的因素有很多，如侧链基团的不同，反应ｐＨ值的不同，植物种类的不同等〔１，２】。在十字花科植物中，硫代葡萄糖苷及其降解产物在植物和昆虫之间有着密切的关系。含硫代葡萄糖苷的植物对于不以含硫代ｇｌｕｃｏｒａｐｈａｎｉｎ的酶解产物，许多研究表明，葡萄糖苷植物为生的昆虫是有毒的，因此它它具有很好的抗癌作用【３—８１。

另外，也有研们不会以十字花科植物为生；但是，对那些究表明苯乙基异硫代氰酸盐（ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ作者简介：第一作者：**萍，女，１９８２出生，（３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）有很好的抑硕士生，从事农产品保鲜和加工研究。制肺癌的作用〔９】。而这些异硫代氰酸盐的产通讯作者：**阳，男，１９６６出生，博士，教授，从事农产品保鲜和加工研究。浙江省２００４年招标项目。人体中的某些肠道菌，也能将硫代葡萄糖１１７ｌ苷降解。例如人体肠道内的多型拟杆菌基．ｐ．Ｄ．配糖物。这些同工酶的最适ＰＨ值范（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ），能将黑芥子围很大，从ｐＨ５到ｐＨ７〔１１，１２〕。目前还未发硫苷酸钾（ｓｉｎｉｇｒｉｎ）分解成异硫氰酸烯丙酯现酶所需要的金属离子。对大多数植物酶来（ａｌｌｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）〔１０】。但是，人类每天说，抑制剂是－ＳＨ试剂，这就说明了半胱氨十字花科植物的摄入量是比较少的，必需利酸残留物在催化反应中是必要的。黑芥子酶用比较多的黑芥子酶的作用，才能产生较多能被维生素Ｃ激活。研究表明加ｌｍＭ维生的有利于人类防癌的物质，以达到很好的防素Ｃ，黑芥子硫苷酸钾的水解速率增加了２５癌及抗癌的作用。

十字花科蔬菜烹饪后食倍ｆ１３〕。但是，在ＰＮＰＧ的水解中，维生素用，仅仅靠肠道菌来降解硫代葡萄糖苷，比Ｃ却不能加快其反应速率〔１４１。生食十字花科蔬菜（本身带有黑芥子酶），人体吸收的异硫代氰酸盐要低１０倍左右。３分离和纯化油菜饼粕蛋白质含量高达３６％以上，且含３．１从植物组织中提取黑芥子酶生猪生长必须的赖氨酸，色氨酸，蛋氨酸等Ｅ．Ｗ．Ｊｗａｎｎｙ等人从萝卜（ｍｐｈａｎｕｓ营养成分！以往由于饼粕中硫代葡萄糖苷含ｓａｔｉｖｕｓ）根中提出了两种黑芥子酶〔１５〕，具量较高，其本身无毒性，但在强酸性条件下，体方法如下：将新鲜根１００９（干重６９）剪或在菜籽饼本身含械幕虺Φ牢慕?碎，５”１２下加蒸馏水研磨，组织匀浆用粗棉子酶的作用下水解。生猪大量食用未脱毒的布过滤，然后４下离心（１３０００转／分钟），油菜饼后，容易产生中毒副作用，这会影响取上清夜在４下用水透析两天，得到酶粗生长育肥猪的增重和饲料转化率，所以需要提液。透析液用硫酸铵盐析，达到１００％饱脱毒或被用作肥料。如果利用高酸性等极端和度，收集沉淀离心（１３０００转／分钟）１５条件降解硫代葡萄糖苷会造成其它营养的分钟。沉淀部分用水溶解，过ＤＥＡＥ．纤维素大量破坏，因此可以利用黑芥子酶和一些含柱，用含０．１．０．５Ｍ氯化纳的Ｎａ－Ｐｉ缓冲液该酶的外源微生物，降低硫代葡萄糖苷的.含（ｐＨ７，１０ｍＭ）梯度洗脱。

收集有活性的量，从而使油菜饼粕应用于饲料。酶，再过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一２００柱，用柠檬酸纳．磷酸缓冲液（ＰＨ６，１０ｒａｍ）洗脱。经过２黑芥子酶的性质ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．２００柱，得到了两种黑芥子酶，黑芥子酶是一种很稳定的酶，而且在细含量分别是０．８ｍｇ和Ｏ．６ｍｇ。胞中长久存在。在细胞中，黑芥子酶与硫代３．２从蚜虫中提取黑芥子酶葡萄糖苷分布在不同的地方，只有当细胞破Ａ．Ｍ．Ｅ．Ｊｏｎｅｓ等人从甘蓝蚜（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ碎时，它们才会聚到一起，继而发生反应，ｂｒａｓｓｉｃａｅ）中分离纯化出了黑芥子酶〔１６】。产生异硫代氰酸盐等，阻止有害物的侵袭。具体方法如下：８．７９冻干的蚜虫在提取缓冲这是一种立即应答，说明在细胞里一直存在液（２０ｒａＭＴｒｉｓ，０．１５Ｍ氯化钠，Ｏ．０２％叠氮着有活性的酶。化物，ｌＯ！ａｇ／ｍｌ亮肽素，ｐＨ７．５）下研磨；然目前，已经用了２９种不同的配糖物去测后离心１２０００转／分钟，３０分钟，除去固体试酶的活性，实验证明，只有４种可以作为沉淀，上清夜中加入硫酸铵，使达到４卜底物，按照降低活性的顺序依次为黑芥子硫６０％的饱和度；过Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（Ｓ．２００）柱，苷酸钾（天然底物），苯甲基葡萄糖异硫氰用Ｔｒｉｓ缓冲液（２０Ｍｍ，０．１５Ｍ氯化纳，酸盐，ｐ．硝基．Ｄ．Ｄ．配糖物（ＰＮＰＧ）和ｏ．硝ｐＨ７．５，Ｏ．０２％叠氮化纳）；收集活性成分，１１７２溶于ｌｍｌ的伴刀豆球蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）中混４．２．２利用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）分析何合，放置过夜；上清液轻轻倒出，ＣｏｎＡ混洪巨等人利用ＨＰＬＣ二级管阵列检测器分合物用上述Ｔｒｉｓ缓冲液洗；收集到的样品通析了硫代葡萄糖苷〔１９】。

ＨＰＬＣ系统包括紫过透析脱盐。透析液为１０ｒａＭ，ｐＨ６的咪唑外检测器（ＳＰ８４５０，ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｓ），波长为两小时，再用２０ｍＭ，ｐＨ６的咪唑透析两小２３０ｎｍ，梯度洗脱泵（Ｍ４８０ＧＴ，Ｇｙｎｋｏｔｅｋ），时；过离子交换色谱柱：ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ柱，用自动进样器（Ｇｉｎａ１６０，Ｇｙｎｋｏｔｃｋ），二级管２０Ｍｍ，ｐＨ６．５的咪唑平衡，用含０．５Ｍ氯阵列检测器波长扫描范围为２００－４００ｎｍ。分化纳的２０Ｍｍ，ｐＨ６．５的咪唑洗脱；脱盐后析柱：ＫｉｃｈｏｓｐｈｅｒｅＲＰ．１８（２５０４ｍｌｎ，再次过ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ柱，收集纯黑芥子酶。Ｍｅｒｃｋ）。流动相Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵，Ｂ：０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵＋３００ｍｌ甲醇，梯度洗脱４黑芥子酶活性测定方法３６ｍｉｎ使硫代葡萄糖苷全部分离。通过标准４．１测定葡萄糖的生成量物质的保留时间鉴定硫代葡萄糖苷。４．１．１利用葡萄糖试剂盒在国外，测定黑袁丽凤等人用ＨＰＬＣ紫外检测器鉴定了芥子酶活性最常用的方法就是用试剂盒测硫代葡萄糖苷【２０】。硫代葡萄糖营的提取：葡萄糖的含量。酶的活力就定义为某段时间取１０ｇ菜籽粉碎，用石油醚于索氏提取器中内葡萄糖含量的增加量。

进行脱脂处理，低温干燥，制得脱脂菜籽粉４．１．２利用分光光度计让黑芥子酶和底备用．取２ｇ脱脂菜籽粉于烧 杯中，在沸水物在合适的条件下反应一段时间，添加３Ｍ浴中干蒸５ｍｉｎ后， 加入２滴巯基乙醇和２５ｍｌ盐酸以终止反应，在３４６ｎｍ处测光密度，水浸 提１５ｍｉｎ，抽滤，取滤液加入４ｍｌ０．５ｍｏｌ从葡萄糖标准曲线上读出 葡萄糖浓度，再计／Ｌ的Ｐｂ（Ａｃ）．Ｂａ（Ａｃ）：溶液，离心。得到算出 黑芥子酶的活性。约２０ｍｌ的提取液。取提取液注入ＤＥＡＥ４．１．３利用 气相色谱法酶和底物反应一ＳｅｐｈａｄｅｘＡ．２５的层析柱中，待溶液流干 后，段时间后，加入内标物（可以用肌醇），真用０．０２ｍｏｌ／Ｌ的醋酸吡 啶溶液和水各空干燥后硅烷化处理：酶１０ｍｇ样品加入ｌｍｌ２０ｍｌ淋洗， 再用Ｏ．５ｍｏｌ／Ｌ的硫酸钾溶液吡啶，再依次加入六甲基二硅胺烷（ＨＭＤ Ｓ）２０ｍｌ洗脱，收集洗脱液备用。液相色谱／和三甲基氯硅烷（ＴＭＣＳ） .【１７】。室温下反质谱条件：色谱柱为ＲｅｌｉａｓｉｌＣ１８柱（５ｍ， 应５ｍｉｎ后即可直接进样分析。注意，反应２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ）：流动 相组成为甲醇／水产物中会有氯化铵沉淀，这并不影响样品的＝１０／９０，含 Ｏ．１三乙胺，用醋酸调节ｐＨ分析，将其低速离心后即可除去。

为５．５；流 动相流速ｌｍｌ／ｍｉｎ；紫外检测波测定葡萄糖的生成量来确定黑芥子酶的长 ２３０ｎｍ；液相色谱／质谱为负离子模式活性的主要问题是：要防止样品中葡 萄糖的电喷雾接口；离子源温度１００；扫描质量干扰。如果提取的黑芥子酶 不纯，还可能存范围２５０一－－８００；数据采集由Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ 化在其它糖苷水解的干扰。学工作站完成。４．２测底物浓度的变化测底物浓度 的变化来确定酶活性的主要４．２．１利用分光光度计以ｓｉｎｉｇｒｉｎ为底 问题是：植物可能有多种硫代葡萄糖苷，检物，在２２７ｎｍ处测ｓｉｎｉｇｒｉ ｎ的浓度。黑芥子测时容易遗漏部分硫代葡萄糖苷。如果用标酶的活力定义为某 段时间内能水解ｓｉｎｉｇｒｉｎ准样品做底物，酶活力仅仅是酶对该种底物的 量【１８】。的酶解活力。ＭＣ在种子中广泛地表达。甘蓝型油菜中的５同工酶 同工酶被大约４．５个ＭＡ，１３个ＭＢ以及３．４许多含硫代葡萄糖苷的植物 都存在多个ＭＣ基因编码。种形式的黑芥子酶，所有植物中黑芥子酶均Ｓｕｓａ ｎｎａＥｒｉｋｓｓｏｎ等人从白芥中分离出了两是糖蛋白，糖含量占９％．２ ３％。黑芥子酶的个ＭＡ和一个ＭＢ型黑芥子酶，分子大小分多样性可以部分地 解释为糖基化程度的不别是６２ＫＤａ，５９ＫＤａ和６５ＫＤａ〔２３１。

目 前，同。因此，这些同工酶的物化性质、动力学从白芥中还没有分离出ＭＣ型的 黑芥子酶。性质、对不同硫代葡萄糖苷的水解速率都是不相同的。６产酶植物， 动物和微生物迄今为止，已经从白芥（Ｓｉｎａｐｉｓａｉｂａ）和黑芥子酶 存在于所有的含有Ｂ．异硫氰酸甘蓝型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）的 种子、茎、盐的植物中，主要存在于十字花科植物中。子叶中提取出了同工酶 〔２１，２２〕。从已经分在一些以含有黑芥子酶的植物为宿主的昆离出的同工 酶中显示，至少存在三种不同基虫中含有黑芥子酶，例如拟步行虫（ｔｅｎｅｂ ｒｉｏ因亚族的黑芥子酶：ＩＶＩＡ、ＭＢ和ＭＣ。ＭＡｍｏｌｉｔｏｒ），黄 条跳甲（ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａｕｎｄｕｌａｔｅ），是可溶性的二聚物，它 只在种子发育过程中甘蓝蚜（ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅｂｒａｓｓｉｃａｅ）， 小菜蛾表达；而ＭＢ和ＭＣ是不可溶性的二聚物，（ｐｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏ ｓｔｅｌｌａ），粉纹夜蛾（ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ它们和其他蛋白质混合在 一起的，一些蛋白ｈｉ）等〔２３，２４，２５〕。质与黑芥子酶结合形成黑芥 子酶．结合蛋白ＳＣｈｅｎａｎｄＢＡＨａｌｋｉｅｒ从啤酒酵母中也提 （ＭＢＰｓ）或黑芥子酶．相关蛋白（ＭｙＡＰ）。

取出来了黑芥子酶〔２６】。 另外从霉菌的链格不同的基因亚族在植物不同组织中表达。孢属（ａｌｔｅｍａ ｒｉａｂｒａｓｓｉｃａｅ）．茎点霉在甘蓝型油菜中的黑芥子酶，通过体内杂 （１ｅｐｔｈｏｓｐｈａｅｒｉａｍａｃｕｌａｎｓ或Ｐｈｏｍａ交以及ｎｏｒ ｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析，表明：ＭＡ主要ｌｉｎｇａｒｎ）也分离出了黑芥子 酶【２３】。在种子和茎中表达；而ＭＢ的ｍＲＮＡ存在于整个萌芽期，也存在于 大多数的成熟植物组织中，但是在幼嫩的组织中含量比较高；参考文献【１】Ｂ ｏｎｅｓ八ＲｏｓｓｉｔｅｒＪＴ．１９９６．１１１ｅｍｙｍｓｉｎａｓｅ— ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅｓｙｓｔｅｍ，ｉｔｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ．９７：ｌ９

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