【标题】东北酸菜加工过程中亚硝酸盐含量变化动态研究【作者】翟【关键词】酸菜亚硝酸盐硝酸还原酶硝酸盐【指导老师】李【专业】生物科学【正文】引言1.1研究目的和意义1.1.1白菜与酸菜的概述大白菜（is），原产于中国，又称“结球白菜”、“黄牙白”、“胶菜”等，是双子叶植物纲白花菜目十字花科芸苔属植物。大白菜有宽大的绿色菜叶和白色菜帮。多重菜叶紧紧包裹在一起形成圆柱体，多数会形成一个密实的头部。被包在里面的菜叶由于见不到阳光绿色较淡以至呈淡黄色。东北酸菜是以大白菜为原料腌制而成，是我国北方冬季保存蔬菜的主要方法，是广大消费者日常餐桌上的佳肴。酸菜在腌制过程中借助于天然附着在蔬菜表面的微生物进行发酵，使成品具有酸、甜、香等独特风味，成为冬季主要蔬菜之一。近年来，随着经济的发展和饮食文化的交流，酸菜的食用人群不仅限于北方和冬季，而是作为一种腌制菜，一年四季以独特的品味受到人们的普遍喜爱，酸菜制作也是从家庭发展到工业化生产，从传统的发酵方法发展到现代化工业生产[1]。1.1.2亚硝酸盐、硝酸盐、硝酸还原酶的概述1、亚硝酸盐的概述常见的亚硝酸盐主要指亚硝酸钠、亚硝酸钾，为白色或淡黄色粉末或颗粒状，味微咸，易溶于水。

亚硝酸盐是强氧化剂，进入血液后与血红蛋白结合，使氧合血红蛋白变为高铁血红蛋白，从而失去携氧能力，导致组织缺氧。另外亚硝酸盐对周围血管有扩张作用。对人体引起危害的亚硝酸盐含量为一次性食用300mg至500mg，口服亚硝酸盐10min到3h后，可出现头痛、头晕、乏力、胸闷、气短、心悸、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、全身皮肤、粘膜紫绀等症状。严重者出现意识丧失、昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡[2]。不仅如此，亚硝酸盐在自然界中极易与胺合成N-亚硝胺，亚硝酸是一种致癌物质，在人体内外与仲胺类作用形成亚硝胺类，它在人体内达到一定剂量时是致癌、致畸、致突变的物质，可严重危害人体健康[3]。2、硝酸还原酶的概述硝酸还原酶（,EC.1.6.6.1,缩写NR）是氮代谢过程中一个重要的调节酶和限速酶[4]。在植物的根和叶中都有该酶的存在，它是一种可溶性的钼黄素蛋白，由黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、细胞色素b557和钼等辅助因子组成。硝酸还原酶对于环境条件十分敏感，如NO3-浓度、温度、pH值、光照等均会影响其活性。硝酸盐的概述硝酸盐由金属离子和硝酸根离子组成的化合物，重要的有：硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、硝酸铅、硝酸铈等。

硝酸盐极易溶于水，所以溶液中硝酸根不与其他阳离子反应，硝酸盐大量存在于自然界中，主要来源是固氮菌固氮形成，或在闪电的高温下空气中的氮气与氧气直接化合成氮氧化物，溶于雨水形成硝酸，在与地面的矿物反应生成硝酸盐。主要用途是供植物吸收氮肥，氮元素不仅是氨基酸与蛋白质的主要成分，还可以合成叶绿素，促进光合作用，所以如果植物缺氮就会叶子枯黄。4、新鲜蔬菜中存在硝酸盐和亚硝酸盐的原因高等植物在生长过程中主要吸收土壤中硝酸盐来转变合成自身生长必须的蛋白质。有机肥料和无机肥料中的氨态氮，在土壤中的硝酸盐生成菌的作用下转变成硝酸盐，植物吸收硝酸盐后，在自身一系列酶的作用下，重新转变成氨态氮，氨态氮与光合作用产生的糖类物质作用，生成氨基酸和核酸，进而高分子化构成植物体。因而新鲜蔬菜中就含有一定量的硝酸盐和亚硝酸盐。据资料分析，我国蔬菜中硝酸盐含量高于国外。特别是萝卜、芹菜、菠菜中含量最多，经研究确定芹菜中含亚硝酸盐0.00mg/Kg硝酸盐l799.l6mg/Kg、白菜中含亚硝酸0.00mg/Kg硝酸盐2327.00mg/Kg、萝卜中含亚硝酸盐0.00mg/Kg硝酸盐2646.00mg/Kg[5]。5、酸菜中的亚硝酸盐近年来大量的研究工作表明：蔬菜在腌制过程中产生亚硝酸盐的根本原因是自然界中大约有100余种菌株具有硝酸还原能力。

如大肠杆菌、副大肠杆菌、摩根氏变形菌等有害菌都可以促使硝酸盐还原成亚硝酸盐，这些有害菌在泡菜发酵过程污染泡菜，使蔬菜中的NO3-厌氧地还原到NO2-的阶段而终止[6、7、8]．使NO2-蓄积起，成为致癌物质的前体物质。1.1.3目的与意义随着经济的不断发展，人们对食品安全要求的提高，酸菜作为酱腌菜的一种，酱腌菜普遍含有亚硝酸盐以及对人体的危害成为了研究热点。有关酱腌菜中亚硝酸盐引起人体中毒的事件屡见报道。有关研究表明，蔬菜是一类富集硝酸盐的作物，人体中80%的硝酸盐来自蔬菜，而酱腌菜独特的腌制工艺——在无氧条件下蔬菜中的硝酸盐在微生物的作用下经硝酸还原酶催化还原为亚硝酸盐，是引起酱腌菜普遍含有较高的亚硝酸盐的主要原因。相关研究表明，酸菜中的亚硝酸盐的含量最高时达250mg/kg，远远高于-2003《酱腌菜卫生标准》中规定酱腌菜中亚硝酸盐含量低于20mg/kg的标准[9]。本文以放置在自然环境中的白菜作为对照，研究酸菜在腌制过程中亚硝酸盐、硝酸盐以及硝酸还原酶的含量的变化。用以得出酸菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化的规律，以及与硝酸还原酶活性、硝酸盐含量变化之间的关系。试图用直接控制亚硝酸盐生成条件或间接通过抑制硝酸还原酶活性来达到降低亚硝酸盐含量的目的。

为加工生产含低亚硝酸盐酸菜提供理论依据，为今后进行相关研究，奠定一定的基础。1.2国内外研究现状目前有关酸菜中亚硝酸盐的研究较少，相关报道有孟良玉等人撰写的《酸菜中亚硝酸盐含量变化规律及降低措施的研究》、庞东卫等人所撰写的《酸菜腌制过程中亚硝酸盐含量的研究》、杨家顺等人所撰写的《长春市市售酸菜亚硝酸盐含量和大肠菌群的分析》等其他相关的文章，对于酸菜中亚硝酸盐的生成机理还未见报道。在《酸菜中亚硝酸盐含量变化规律及降低措施的研究》中作者使用的实验浓度分别为6%、12%、15%，分别腌制8d、10d、15d时，酸菜中亚硝酸盐含量最高，而后迅速降低，35d后基本完全降解。在《长春市市售酸菜亚硝酸盐含量和大肠菌群的分析》中作者结果所得：家庭腌制酸菜的亚硝酸盐含量变化在第4天时达到峰值51.2mg/kg，然后迅速降低，在第7天回落到4.7mg/kg，然后几天亚硝酸盐的含量稍有回升，但亚硝酸盐的含量的总体维持在10mg/kg以内。在《酸菜腌制过程中亚硝酸盐含量的研究》中作者分别取5种不同浓度的NaCl浓度腌制（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%），在NaCl浓度为1.5%时亚硝酸盐含量最低，而在此浓度下酸菜中的亚硝酸盐含于第32到峰值，以后均下降。

通过这些相关文献的论述，我们对酸菜腌制过程中亚硝酸盐含量的动态变化有一个初步的认识，但是究竟是何时达到峰值，还需进一步研究。并且弄清酸菜研制过程中亚硝酸盐的生成机制，以及与硝酸还原酶活性的关系。材料与方法2.1材料所用的材料是购买的新鲜大白菜、食盐。2.2仪器与设备CR226型冷冻离心机、-756分光光度计、HH.sy21-Ni电热恒温水浴锅、电子分析天平、BP1-B-4电子天平、BCD-218 冰箱、组织捣碎机。 方法2.3.1 实验原理 1、亚硝酸盐含量的测定 用国家标准测定法，在波长538nm 处测量生成的红色复合物的吸光度，计算样品中亚硝酸离 子（NO2-）含量[10]。 2、硝酸还原酶活性的测定 测定硝酸还原酶活性的方法通常采用离体法[11]，在540nm 波长下测量生成的红色偶氮化合 物的吸光度，计算样品中的硝酸还原酶的活性。 3、硝酸盐含量的测定 用紫外分光光度法，在紫外波长220nm 处测量硝酸根离子的吸光度，计算样品硝酸盐含量， 从而准确快速测定蔬菜硝酸盐含量[12]。 2.3.2 实验试剂 亚硝酸钠标准溶液，0.1mol?L-1 pH7.5 磷酸缓冲液，0.1mol?L-1 KNO3，NADH 溶液，提取缓 冲液（称取半胱氨酸0.61g，乙二胺四乙酸二钠（）1.86g，溶于250ml 磷酸缓冲液 中，用KOH 调pH 至7.5，定容至），1%磺胺，0.02%N 萘乙二胺盐酸盐，饱和硼砂溶液，0.25 mol?L-1 亚铁氰化钾溶液，1 mol?L-1 乙酸锌溶液。

2.3.3 实验操作步骤 3.1标准曲线与回归方程的制备 1、亚硝酸盐标准曲线与回归方程的制备 用移液管吸取亚硝酸钠标准溶液0、0.5、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分别加入7 个50ml 容量 瓶中，各加水至约30ml；然后加入5.0ml 溶液I，3.0ml 溶液III 混匀，至于室温遮光处， 再加入1.0ml 溶液II 混匀，3min 后用水定溶，于538nm 处测其吸光度，绘制成标准曲线。 图2.1 吸光度与亚硝酸盐绘制标准曲线 亚硝酸盐与ABS 建立的一元线性回归方程：y=0.2271x+0.0014,线性相关系数r=0.9997 2、硝酸还原酶标准曲线与回归方程的制备 支干净试管，编号，按表2-1加入试剂：摇匀，后在室温下放置20min，然后在540nm 波长下测定吸光度，以亚硝酸含量（μ g）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（见 图2.2）。 表2-1 制作标准曲线时各物质的加入量 亚硝酸钠标准液(ml) 0.20.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 (ml) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 2.04.0 6.0 8.0 10 1％磺胺 （ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 N-萘乙二胺盐酸盐（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.8 2.0 2.2吸光度与亚硝根绘制标准曲线 亚硝酸盐与ABS 建立的一元线性回归方程：y=0.1094x+0.0172,线性相关系数r=0.9991 3、硝酸盐标准曲线与回归方程的制备 吸取硝酸根标准贮备液0，2，4，6，8，10，12，14mL，分别加入8 个100mL 容量瓶中，用 去离子水定容至刻度，摇匀，此标准系列溶液NO3-质量浓度分别为0，2，4，6，8，10，12， 14mg/L，在紫外分光光度计上，用1cm 石英比色杯于220nm 处测定吸光度，画标准曲线（见 图2.3）。

硝酸盐与ABS建立的一元线性回归方程：y=0.0588x+0.0036,线性相关系数r=0.9999 3.2酸菜腌制过程 盐水 白菜 清洗 密封发酵 成品 图2.3 吸光度与硝酸盐绘制标准曲线 2.3.4 食用安全性评价方法 （1）白菜的安全性评价以国家标准GB 18406-2001 蔬菜中硝酸盐限量标准为依据。标准中 规定根茎类硝酸盐的含量应1200 mg.kg-1，亚硝酸盐4.0 mg.kg-1 [13]。 （2）酸菜的安全性评价以国家标准-2003《酱腌菜卫生标准》为依据。-20《酱

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