浙江大学殷学仁教授课题组：转录组分析揭示外源乙酰水杨酸提高鲜切猕猴桃抗氧化活性的作用机理

●研究背景:水杨酸（ acid, SA）又名邻羟基苯甲酸，是一种小分子酚类化合物，普遍存在于高等植物细胞中。作为一种植物内源激素，SA不仅广泛参与种子萌发、叶片光合作用、开花诱导等生长发育过程，还与植物的逆境胁迫响应密切相关。植物体内水杨酸的生物合成主要有两条途径，即异分支酸合酶途径和苯丙氨酸解氨酶途径，二者在不同种植物中的贡献程度存在较大差异。近年来相关研究表明，外源施用SA及其衍生物在延缓果实成熟、提高系统抗性和维持果实品质方面具有重要作用。

猕猴桃果实细嫩多汁，富含有机酸、天然色素和抗氧化物质，尤其是抗坏血酸含量远高于其他水果，因此是著名的抗氧化水果。鲜切猕猴桃的采后品质劣变主要表现为快速软化、失水皱缩以及风味和抗氧化性能的损失。此前已有研究报道利用臭氧水、柠檬酸浸泡、气调贮藏等处理可有效维持鲜切猕猴桃的保鲜期，然而这些处理均存在局限性，产业上仍需寻找无毒、高效且环保的鲜切猕猴桃保鲜剂。相关研究表明，尚未发现SA在鲜切猕猴桃中的应用，SA及其衍生物能否应用于鲜切猕猴桃的保鲜以及适宜的使用浓度和处理措施等均需要作进一步研究和探索。

因此，本文使用SA衍生物乙酰水杨酸（ acid, ASA）浸泡处理鲜切猕猴桃，于4 ℃贮藏期间分析了猕猴桃切片中与抗氧化有关的活性物质及抗氧化能力的变化，并通过转录组测序和加权基因共表达网络分析（ gene co- , WGCNA）重点研究了ASA处理对鲜切猕猴桃抗坏血酸生物合成的影响。本研究不仅在转录层面上阐明了ASA提升鲜切猕猴抗氧化性能的分子机制，同时也为植物激素及衍生物在鲜切猕猴桃保鲜中的应用奠定了基础。

成果介绍

结果与分析

1. ASA处理对鲜切猕猴桃抗氧化能力的影响

多酚类物质是广泛分布于植物体内的天然次生代谢产物，具有较强的抗氧化能力和自由基清除能力，常被报道有利于预防和控制心血管疾病和糖尿病。酚类物质容易被氧化形成邻醌，是引起果实褐变的主要因素；果实受到机械损伤后会刺激酚类物质的合成，导致总酚含量上升。如图1A所示，对照组和ASA处理组中总酚含量都随着贮藏时间的延长逐渐增加，而ASA处理组的总酚含量始终高于对照组，且在贮藏12 d时相较于对照样品提高了28%，这表明ASA处理可以诱导鲜切猕猴桃多酚物质的积累。

抗坏血酸又称作VC，是一种具有强还原性的营养物质，由于人体无法合成，所以必须从饮食中摄入。果蔬中的抗坏血酸通常较不稳定，贮藏过程中一旦暴露于光照或有氧环境中就会快速降解，因此抗坏血酸含量常被用于衡量果蔬的新鲜程度。如图1B所示，‘红实’猕猴桃经鲜切处理后抗坏血酸初始含量为0.154 mg/g，且随着贮藏时间的延长逐渐降低；而ASA处理的果实在整个贮藏期间抗坏血酸含量均显著高于对照组，在4 d时约为对照组的2.5倍，这可能是由于ASA处理诱导了抗坏血酸合成通路中相关基因的表达从而促进了抗坏血酸的积累。

DPPH自由基是一种具有强氧化性的自由基，会对组织和细胞造成损伤；鲜切果蔬提取物对DPPH自由基的清除能力是衡量其总抗氧化能力的指标之一。如图1C所示，贮藏初期，对照组和处理组样品的DPPH清除率没有显著差异，直到贮藏8、12 d后，ASA处理组的DPPH清除率显著高于对照组。在12 d时ASA处理组相较于对照组样品DPPH清除率提高了约21%，这表明ASA处理组的鲜切猕猴桃具有更好的抗氧化性能。

2. 转录组分析和WGCNA揭示影响鲜切猕猴桃抗坏血酸合成的候选基因

为了研究ASA处理后鲜切猕猴桃中基因转录水平的变化，通过转录组测序鉴定与抗氧化性能变化相关的基因。差异表达分析结果显示对照组和ASA处理组的样品在4、8、12 d时分别包含1 842、3 592 和1 038 个DEG，取三者的并集共获得5 032 个DEG以作后续分析。

WGCNA是一种常用的转录组分析方法，利用WGCNA将得到的5 032个DEG按照基因表达趋势划分为12个模块，同一模块中的基因具有相似的表达模式（图2A）。研究人员从抗坏血酸含量的变化出发，重点关注了影响抗坏血酸生物合成的基因。通过计算各个模块中基因与生理数据（总酚、抗坏血酸和DPPH清除率）的相关性，发现‘brown’和‘black’两个模块与抗坏血酸含量的相关性最高（图2B）。这两个模块各包含337、827个基因，随后以单个基因与自身模块的相关性MM值＞0.85为标准，从两个模块中分别筛选出207、276个基因，共获得483个基因作后续分析。

3. ASA介导抗坏血酸合成的关键基因筛选

对WGCNA获得的483 个候选基因依据基因表达量作进一步筛选，以基因在21 个样本中最大FPKM值＞50为标准共鉴定到138 个基因。KEGG聚类分析结果显示，该138 个候选基因主要与次生代谢物合成和代谢途径相关（图3）。此外，KEGG注释结果显示（）基因参与抗坏血酸和糖醛酸的代谢过程。

高等植物体内抗坏血酸合成存在4条可能途径：L-半乳糖途径、古洛糖途径、D-半乳糖醛酸途径和肌醇途径，其中L-半乳糖途径是研究较为系统的主要途径。研究人员利用WGCNA鉴定到的基因编码一个L-半乳糖途径中的关键酶L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶（L- , GPP），通过将L-半乳糖-1-磷酸去磷酸化生成L-半乳糖。转录组数据显示，ASA处理组的鲜切猕猴桃中的基因表达始终高于对照组，且在贮藏8 d时差异最大，达到了3.4倍（图4A）。荧光定量PCR结果也证实了这一结论（图4B）。综上，ASA处理显著诱导了低温贮藏环境下基因的表达，促进了鲜切猕猴桃抗坏血酸的合成与积累。

4. 候选基因中的转录因子分析结果

近年来，相关研究表明，许多转录因子通过结合抗坏血酸生物合成通路中的关键基因启动子，参与调控抗坏血酸的合成与积累，例如中华猕猴桃乙烯响应因子调控，毛花猕猴桃MYB家族转录因子和bZIP家族转录因子调控，以及番茄bHLH家族转录因子调控L-半乳糖途径中的一系列关键基因。研究人员根据基因功能注释，在上述138个候选基因中鉴定到了13个差异表达转录因子，分别属于ERF、bHLH、bZIP、C2H2、NAC和WRKY家族。转录组数据显示，这些转录因子均受ASA处理的诱导表达（图5）。

随后研究人员从猕猴桃基因组数据库（ cv. Red5）中获取到基因上游1 000 bp的启动子序列，利用软件对该序列中的顺式作用元件和反式作用因子进行预测分析。结合上述鉴定到的6个转录因子家族，结果发现该启动子片段包含除了NAC家族以外的其他转录因子的结合位点（表1）。这些顺式作用元件的存在，预示着基因较大可能受上述转录因子的调控，而ASA处理正是通过这些转录因子参与到鲜切猕猴桃抗坏血酸的生物合成过程。

结 论

果蔬是人体摄取维生素和矿物质的重要膳食来源，其品质性状是衡量果蔬商品价值的主要因素。果实在采后贮藏期间的品质劣变通常伴随着抗坏血酸、多酚等营养物质的损失，导致抗氧化性能降低。鲜切猕猴桃的贮藏保鲜一直是产业发展亟待解决的问题，尽管近年来已开发出一些切片的保鲜手段，然而对植物内源激素及其衍生物的应用及研究仍较少。此前已有研究表明水杨酸在维持不同果实的质地、色泽、香气、风味和营养品质方面发挥重要作用。本研究中，水杨酸衍生物ASA处理能够有效提高鲜切猕猴桃的抗氧化能力，同时促进酚类物质和抗坏血酸的生物合成，维持了果实的营养价值，这与早期在青花菜、苹果、南瓜、梨中的相关研究结果一致。

随后重点研究ASA对抗坏血酸的生物合成的影响：结合转录组测序和WGCNA共筛选到138个响应ASA处理且与抗坏血酸含量高度相关的候选基因，这其中包含1个猕猴桃抗坏血酸合成的关键基因和13个差异表达的转录因子，分别属于ERF、bHLH、bZIP、C2H2和WRKY等家族。高等植物体内抗坏血酸的合成通常有4条途径，其中L-半乳糖途径的研究较为深入；该途径中的GPP是一种磷酸酶，以L-半乳糖-1-磷酸为底物生成L-半乳糖，并进一步合成抗坏血酸。猕猴桃基因已被证实参与抗坏血酸代谢，然而其对果实抗坏血酸含量的影响仍有待通过猕猴桃同源转基因实验进行基因功能验证。

进一步预测了13个转录因子对可能存在的调控作用，发现启动子上包含多个转录因子家族的结合元件。这些预测结果有待通过双荧光素酶、凝胶迁移实验、酵母单杂等实验体系进行转录因子启动子的相互作用验证。此外，本研究仅关注了抗坏血酸合成的L-半乳糖途径中的GPP，该途径中其他酶以及其他途径中的基因是否受到ASA的影响，仍有待作进一步探索。

团队简介

殷学仁 教授

浙江大学农业与生物技术学院

殷学仁，浙江大学农业与生物技术学院，教授，博士生导师。先后获国家优秀青年基金、教育部霍英东青年教师基金、全国百篇优秀博士论文提名奖。现兼任 and 副主编（TOP期刊）、New of Crop and 副主编（SCI收录）、编委（SCI收录）、中国园艺学会青年分会副理事长、中国园艺学会柿分会常务理事、国家林业和草原局科技创新联盟常务理事。以第一作者/通讯作者先后在《 in Plant 》、《New 》、《Plant 》、《 of 》、《Plant 》、《The Plant 》、《 of 》、《Plant, Cell&》、《Food 》、《 of and Food 》、《》、《 and 》等期刊发表系列学术论文。先后承担国家自然科学基金（优秀青年基金、面上项目、青年基金）、国家重点研发计划课题、公益性（农业）行业专项（课题）、霍英东教育基金会青年教师基金、973计划（子课题）、863计划（子课题）、浙江省自然科学基金（杰出青年基金）、教育部博士点基金等。

团队主要从事猕猴桃和柿果实的品质及贮藏保鲜生物学基础研究，包括果实品质（质地、风味、色泽等）形成机理、成熟与衰老分子机理解析、转录因子及调控机制研究和采后保鲜技术工艺研发/优化等。

主要研究领域

猕猴桃和柿果实品质形成与调控、品质维持与贮藏保鲜、植物激素代谢及调控、环境应答机制、贮藏保鲜技术。

王文球 博士

浙江大学农业与生物技术学院

王文球博士，新西兰植物与食品研究所访问学者（博士后国际交流计划派出项目），主要从事果实成熟衰老及品质生物学研究、非编码RNA研究，以第一/通讯作者先后在《New 》（2篇）、《 in Plant 》、《 》、《 and 》发表论文，并先后获得中国博士后科学基金和国家自然科学基金青年项目资助。

王 戬 博士

浙江大学农业与生物技术学院

王戬博士，目前就职于中国科学院武汉植物园，先后在《 》、《 and 》、《New of Crop and 》发表论文。

团队成员介绍

【食品加】汇聚了8W+行业精英，建立了50多个食品领域教师专家群、科研群（食品营养与健康科研群、食品安全与检测科研群、食品加工与贮藏科研群、食品风味与感官科研群、食品胶体与递送科研群、食品生物技术科研群、人工智能与食品科学科研群，还有更多细分领域交流群陆续建立中ing）、海外食品人才群、企业研发群、求职就业群。欢迎小伙们加入，一起交流、共同成长！

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